Antinuclear Antibody (ANA)

Antinuclear Antibody (ANA)

---

1. บทนำ (INTRODUCTION)

• ANA เป็นแอนติบอดีต่อโครงสร้างนิวเคลียส/ไซโตพลาสซึม ช่วย “สนับสนุน” การวินิจฉัยโรคระบบภูมิคุ้มกันทำลายตัวเองโดยเฉพาะ SLE และกลุ่ม connective tissue disease อื่น ๆ
• การ “ไม่มี” ANA โดยเฉพาะเมื่อใช้ IIF ที่ไวดี ทำให้โอกาสเป็น SLE ลดลงมาก (แต่ไม่ใช่ศูนย์)
• การใช้ ANA อย่างมีประสิทธิภาพต้องเข้าใจ

1.       ข้อจำกัดของการตรวจ

2.       เทคนิคที่ใช้ตรวจ (IIF vs solid-phase assay)

3.       การแปลผลเรื่อง titer และ pattern รวมถึง DFS70 / ICAP pattern ต่าง ๆ (BioMed Central)

---

2. Clinical utility และข้อจำกัดสำคัญ

2.1 ความชุกของผลบวกและ false positives

• IIF – ที่ dilution 1:160 จะให้ผลบวกใน ≈5% ของคนปกติ ซึ่งถูกตั้งใจให้ไวต่อ SLE และ CTD อื่น ๆ
• แต่โรค ANA-associated autoimmune disease ในประชากรทั่วไปพบรวม ๆ ประมาณ 1% → หมายถึงว่า ผล ANA บวกส่วนใหญ่เป็น false positive (ประมาณ 4 ใน 5 รายใน setting general population)
• ความชุก ANA บวกสูงขึ้นใน
• ผู้หญิง
• ผู้สูงอายุ (BioMed Central)

ข้อสรุปเชิงปฏิบัติ

ANA ไม่เหมาะเป็น screening test ในคนปกติหรือคนที่มีอาการ vague เช่น ปวดเมื่อยทั่วตัว ไม่มี objective sign ของ CTD

2.2 ความสำคัญของ pretest probability

ANA มีประโยชน์เมื่อใช้ในผู้ที่ มี moderate–high clinical suspicion ของ systemic autoimmune disease เช่น

• SLE – ผื่นแบบ photosensitivity, oral ulcer, serositis, cytopenia ฯลฯ
• SSc – Raynaud, sclerodactyly, skin thickening, telangiectasia
• Sjögren’s disease – sicca, parotid enlargement, positive Schirmer
• MCTD, DM/PM, Raynaud ที่สงสัย secondary, autoimmune hepatitis, PBC ฯลฯ

ในผู้ป่วยที่มีอาการเพียงปวดกล้ามเนื้อ-ข้อ + fatigue แบบไม่จำเพาะ การส่ง ANA แบบเหวี่ยงแหจะได้ผลบวกปลอมเยอะและพา diagnostic workup “หลงทาง”

---

3. โรค/ภาวะที่สัมพันธ์กับ ANA บวก

3.1 กลุ่ม Rheumatologic

• SLE / drug-induced lupus
• Mixed connective tissue disease (MCTD)
• Systemic sclerosis (SSc)
• Sjögren’s disease (SjD)
• Rheumatoid arthritis (RA)
• Dermatomyositis / Polymyositis (DM/PM, JDM)
• Juvenile idiopathic arthritis (JIA) – บาง subtype

3.2 Non-rheumatologic

• Organ-specific autoimmune disease
• Hashimoto thyroiditis, Graves’ disease
• Autoimmune hepatitis
• Primary biliary cholangitis (PBC)
• บางรายของ IBD, interstitial lung disease
• Infection – EBV, HIV, HCV, parvovirus B19 เป็นต้น
• Malignancy / paraneoplastic – lymphoma, HCC, paraneoplastic syndrome บางชนิด
• ยา – TNF inhibitors, minocycline ฯลฯ
• Family history of autoimmunity – พบ ANA ในคนยังไม่ป่วย แต่มี first-degree relative เป็น autoimmune disease

---

4. เทคนิคการตรวจ ANA และข้อดี–ข้อเสีย

4.1 Indirect Immunofluorescence (IIF) บน HEp-2 cells – มาตรฐานอ้างอิง

หลักการสั้น ๆ
ใช้เซลล์ HEp-2 (นิวเคลียสใหญ่ มี antigen ครบ) ย้อมด้วย serum ผู้ป่วยแล้วตามด้วย fluorescein-labeled anti-human Ig → ดูลักษณะ fluorescence และ serial dilution เพื่อหาตัวเลข titer

ข้อดี

• ตรวจ autoantibody ได้หลากหลายมากในคราวเดียว
• ไวต่อ systemic autoimmune disease สูงกว่าส่วนใหญ่ของ solid-phase assay โดยเฉพาะ SLE/SSc/SjD (MDPI)
• ให้ข้อมูล titer + pattern ซึ่งช่วยตีความเพิ่มเติม
• ปัจจุบันหลาย lab มีระบบอ่านแบบ automated ช่วย standardize

ข้อเสีย

• Labor-intensive และต้องอาศัยผู้เชี่ยวชาญอ่าน pattern
• ไม่สามารถระบุชื่อ autoantibody ได้ตรง ๆ → มักต้องต่อด้วย solid-phase (ENA/dsDNA panel)
• อาจมี false negative ในบาง antibody ที่เตรียม slide ไม่เหมาะสม เช่น anti-Ro60, anti-ribosomal P

---

4.2 Solid-phase assays (ELISA, bead-based, line blot ฯลฯ)

ข้อดี

• ทำได้แบบ high-throughput, automated
• รายงานเป็น “ชื่อ antibody” เลย เช่น anti-dsDNA, anti-Sm, anti-Scl70 ฯลฯ
• เหมาะสำหรับ confirm/จำแนก autoantibody หลังพบ ANA บวกด้วย IIF

ข้อเสีย

• แพเนล antigen จำกัดกว่าบน HEp-2
• ไวต่ำกว่า IIF ในการ screen systemic autoimmune disease หลายโรค
• ไม่ค่อยมี antigen nucleolar / mitotic บางชนิด → เสี่ยง false negative หากใช้เป็น “screening test ตัวแรก” เพียงอย่างเดียว (MDPI)

หลักคิดที่แนะนำ

1.       ถ้าเป็นไปได้ ให้ใช้ IIF เป็น screening test ตัวแรก

2.       เมื่อ ANA IIF บวก → ใช้ solid-phase เพื่อหา autoantibody จำเพาะตาม clinical context + pattern

3.       ถ้า lab ใช้ solid-phase เป็น screening แล้วออก “negative” แต่ clinical suspicion สูง → ควรขอ IIF HEp-2 เพิ่ม

---

5. การตีความ ANA โดย IIF

5.1 ตกลงว่า “ค่าไหนคือ positive?”

• หลักการที่ยอมรับ คือ เลือก dilution ที่ทำให้คนปกติ ≈5% เป็นบวก (มักราว ๆ 1:160)
• หลายห้องแล็บถือ ≥1:160 เป็น positive
• ACR/EULAR SLE classification criteria ใช้ cut-off ANA IIF ≥1:80 เป็น entry criterion (BioMed Central)

แนวคิดสำคัญ

• Low titer (เช่น 1:40, 1:80) → พบมากในคนปกติ, elderly, female → ถ้าไม่มี clinical feature ก็มีโอกาสเป็น false positive สูง
• High titer (≥1:320 หรือ ≥1:640) → โอกาสสัมพันธ์กับ autoimmune disease สูงขึ้น แต่ “ไม่จำเพาะ” ต้องผูกกับอาการและ specific antibodies

5.2 ความหมายของ titer

• ใช้ช่วย “ประเมินความน่าจะเป็นของ systemic autoimmune disease” แต่ ไม่ใช่ ตัววินิจฉัย
• เมื่อตรวจพบ ANA บวกในผู้ป่วยที่วินิจฉัยโรคแล้ว → ไม่ใช้ติดตาม disease activity (ต่างจาก anti-dsDNA, complement) (MDPI)

---

6. การแปลผลตาม staining pattern ที่พบบ่อย (สรุปแบบใช้งาน)

หมายเหตุ: pattern มีค่าสำหรับ “ช่วยเดา autoantibody และแคบ differential” แต่ไม่จำเพาะต่อโรคใดโรคหนึ่ง

6.1 Nuclear patterns

6.1.1 Homogeneous (AC-1)

• ลักษณะ: นิวเคลียสติด diffuse ทั้งหมด + chromosome ติดใน mitotic cells
• โรคที่พบบ่อย:
• SLE, drug-induced lupus
• SjD, SSc, RA
• Hashimoto thyroiditis, PBC, autoimmune hepatitis
• Autoantibody ที่พบบ่อย: anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-histone

6.1.2 Speckled – fine / coarse

Fine speckled (AC-4)

• พบใน SLE, subacute cutaneous SLE, SjD, SSc, DM/PM, RA
• Antibody ที่พบได้: anti-Ro60, anti-La, anti-Scl70, anti-Ku, anti-Mi-2, anti-TIF1γ, anti-MDA5 เป็นต้น
• ช่วยคิดถึงกลุ่ม SjD, SSc, myositis ตาม clinical context

Coarse speckled (AC-5)

• พบใน SLE, MCTD
• Antibody หลัก: anti-Sm, anti-U1 RNP → ชี้ไปทาง SLE/MCTD

6.1.3 Dense fine speckled (DFS pattern, AC-2) – จุดสำคัญ

• ลักษณะ: speckle แน่นทั่วนิวเคลียส (ไม่ติด nucleoli) และติดกับ chromosome ใน mitosis
• ส่วนใหญ่เกิดจาก anti-DFS70 (anti-LEDGFp75)
• งานวิจัยจำนวนมากพบว่า pattern นี้พบบ่อยในคนสุขภาพดี และสัมพันธ์กับ systemic rheumatic disease น้อยมาก โดยเฉพาะเมื่อเป็น “isolated DFS70” (PubMed)
• ถ้า pretest probability ต่ำ และตรวจยืนยันว่าเป็น anti-DFS70 mono-specific → มักถือเป็น “ผลบวกที่น่าจะไม่ใช่โรค CTD” และใช้ช่วย reassure ผู้ป่วยได้
• แต่ถ้า clinical suspicion สูง → ยังต้องตรวจ ENA/dsDNA เพิ่ม เพราะ DFS70 pattern อาจกลบ pattern อื่นได้

6.1.4 Nucleolar (AC-8/9/10)

• ลักษณะ: ย้อมเฉพาะ nucleoli แบบ homogeneous / clumped / punctate
• พบบ่อยใน SSc (ประมาณ 15–40%) และมีความหมายด้าน prognosis (ILD, PAH, renal crisis ตามชนิด antibody)
• Autoantibody สำคัญ: anti-PM/Scl, anti-U3 RNP (fibrillarin), anti-Th/To, anti-RNA polymerase I/III, anti-Scl70

6.1.5 Nuclear dots

• Centromere pattern (AC-3)
• จุดใหญ่ 30–60 จุดในนิวเคลียสเรียงตาม chromosome ใน metaphase
• ชี้ไปที่ limited SSc (CREST), PBC, SjD, Raynaud
• Antibody: anti-centromere A/B/C
• PML-Sp100 nuclear body (AC-6)
• จุด 5–20 จุด ไม่ติด chromosome
• Specific มากสำหรับ PBC (ใช้ยืนยันโดย solid-phase)
• Cajal bodies (AC-7)
• จุดขนาดใหญ่ไม่กี่จุด ความจำเพาะต่ำ ความหมายทางคลินิกค่อนข้างจำกัด

6.1.6 Nuclear envelope (AC-11/12)

• Continuous linear → พบได้ใน SLE, SjD, APS, autoimmune liver disease (spec. ไม่สูง)
• Discontinuous (anti-gp210) → ช่วยสนับสนุน PBC (specific สูง) → ควรยืนยันด้วย ELISA

6.2 Cell-cycle related patterns

• PCNA (AC-13) – เคยคิดว่าเจาะจง SLE แต่ข้อมูลใหม่บอกว่าความจำเพาะต่ำ พบได้ใน autoimmune อื่น, viral hepatitis, malignancy
• CENP-F (AC-14) – พบสัมพันธ์กับ malignancy สูง (breast, lung, prostate, lymphoma ฯลฯ)

6.3 Cytoplasmic patterns

6.3.1 Antimitochondrial antibody (AMA, AC-21)

• Granular/filamentous staining ทั้ง cytoplasm
• ถ้า confirm เป็น anti-PDC–E2 เป็นต้น → ชี้ไปที่ PBC เป็นหลัก (แต่พบได้ในโรคอื่นบ้าง)

6.3.2 Cytoplasmic fine speckled (AC-19/20)

• Autoantibody ที่พบบ่อย:
• Anti-Jo-1 / อื่น ๆ ในกลุ่ม anti-synthetase → myositis + ILD + mechanic’s hands
• Anti-signal recognition particle (SRP) → necrotizing myopathy
• Anti-ribosomal P → SLE (โดยเฉพาะ neuropsychiatric)
• Anti-Ro52
• ใช้ร่วมกับ clinical picture เพื่อชี้ไปสู่กลุ่ม myositis/SLE/SjD

6.3.3 Cytoskeletal (AC-15/16/17), Golgi (AC-22), “Rods and rings” (AC-23)

• Cytoskeletal – ถ้ามี anti-actin → ช่วยสนับสนุน autoimmune hepatitis type I
• Golgi – รายงานน้อย ความจำเพาะต่ำ
• Rods and rings – เคยพบเด่นในผู้ป่วย HCV ที่ได้รับ interferon + ribavirin

---

7. การใช้ solid-phase assay ในการแปลผล

• เมื่อ ANA IIF บวก → ใช้ ENA/dsDNA panel เลือกตาม clinical question + pattern
• SLE → dsDNA, Sm, RNP, ribosomal P
• SSc → Scl70, centromere, RNA polymerase III, PM/Scl, U3RNP
• SjD → Ro60, Ro52, La
• DM/PM → Mi-2, MDA5, TIF1γ, Jo-1, SRP ฯลฯ
• PBC → AMA, Sp100, gp210
• ถ้าเริ่มตรวจด้วย solid-phase แล้ว “positive” อยู่แล้ว (เช่น ANA-ELISA รวมที่รายงาน Ro/La/Sm ฯลฯ) → อาจไม่จำเป็นต้องส่ง IIF ในทุกกรณี แต่หาก picture ไม่ชัด หรือสงสัย pattern nucleolar/mitotic ควรทำ IIF เพิ่ม

---

8. แนวทาง follow-up และการส่งตรวจเพิ่ม

8.1 เมื่อ ANA IIF เป็นบวก

• ดูร่วมกับ clinical context + pattern แล้วตัดสินใจส่ง specific autoantibody
• ในผู้หญิงวัยเจริญพันธุ์/มีโอกาสตั้งครรภ์ → ถ้า ANA บวกควรพิจารณาส่ง anti-Ro/SSA และ anti-La/SSB เพราะมีนัยสำคัญต่อ risk ของ neonatal lupus / congenital heart block

8.2 เมื่อ ANA IIF เป็นลบ

• ถ้า clinical suspicion ของ SLE/SjD/SSc ต่ำ → มักไม่ต้องทำอะไรเพิ่ม
• ถ้า suspicion สูง (เช่น picture ลักษณะ SLE แต่ ANA ลบ) → พิจารณา
• ตรวจ specific antibodies ที่อาจไม่เห็นบน HEp-2 (anti-Ro60, Ro52, ribosomal P ฯลฯ) ด้วย solid-phase
• ทบทวนว่าใช้ slide ประเภทใด (Ro60 บาง preparation หายไป)

8.3 เมื่อเริ่มต้นด้วย solid-phase ANA

• ถ้า “positive” พร้อมระบุ autoantibody ชัด (เช่น anti-centromere, anti-Scl70, anti-Sm) → ใช้ประกอบการวินิจฉัยได้เลยในบริบทที่เหมาะสม
• ถ้า “negative” แต่สงสัย disease สูง → ควรส่ง ANA IIF เพราะ solid-phase ไวต่ำกว่าและ antigen ไม่ครบ

8.4 การตรวจซ้ำ ANA

• ผู้ป่วยที่ ANA negative และไม่มีอาการใหม่ → ไม่ควรตรวจซ้ำเป็น routine
• ผู้ป่วยที่วินิจฉัย CTD แล้ว → ไม่ใช้ ANA titer ติดตาม activity; ใช้ anti-dsDNA, complement, inflammatory markers แทนใน SLE
• การตรวจซ้ำมีประโยชน์เฉพาะเมื่อมี อาการ/สัญญาณใหม่ ที่ชวนให้คิดว่าอาจมี CTD เกิดขึ้นหรือเปลี่ยน phenotype (MDPI)

---

9. การอธิบายผล ANA บวกในผู้ป่วยที่ clinical suspicion ต่ำ

Key message ที่ควรบอกผู้ป่วย:

1.       การที่ ANA บวก “ไม่ได้แปลว่ามีโรค SLE หรือโรคภูมิคุ้มกันเสมอไป”

2.       เนื่องจากการตั้งค่าการตรวจ ทำให้ ≈5% ของคนปกติจะ ANA บวกอยู่แล้ว (และในบางงานพบ ANA บวกได้ถึง 12–20% ขึ้นกับเกณฑ์และประชากร) (BioMed Central)

3.       ความเสี่ยงจะเป็น autoimmune disease จริง ๆ ยังต่ำมาก เมื่อไม่มีอาการ/สัญญาณทางคลินิก

4.       อย่างไรก็ตาม ANA อาจปรากฏล่วงหน้าเป็น “marker ล่วงหน้า” ได้หลายปีก่อนเกิดโรค จึงควรให้ผู้ป่วยสังเกตอาการ (rash, photosensitivity, arthritis, Raynaud, sicca ฯลฯ) และกลับมาตรวจซ้ำเมื่อมีอาการ

5.       ถ้าพบว่าเป็น isolated anti-DFS70 โดยไม่มี ENA/dsDNA อื่น และไม่มีอาการ → สามารถใช้ผลนี้ช่วย “reassure” ว่าโอกาสเป็น systemic rheumatic disease ต่ำมาก แต่ยังต้องติดตามตามอาการในระยะยาว (PubMed)

---

10. ข้อพิจารณาในเด็ก (Pediatric ANA)

• ความชุก ANA บวกในเด็ก (ตาม cut-off 1:40–1:80) ประมาณ 12–15% และพบมากในเด็กผู้หญิง
• เด็กมีอัตรา infection สูง ซึ่งอาจทำให้ได้ ANA บวกชั่วคราว → ห้ามใช้ ANA เป็น screening ในเด็กที่มีอาการ vague
• การใช้ ANA ในเด็กที่สำคัญ
• ช่วยวินิจฉัย SLE, JDM, SjD ในรายที่มี clinical feature ชัด
• ใน JIA (โดยเฉพาะ oligoarticular JIA, seronegative polyarticular, psoriatic JIA) – ANA บวกที่ค่าใด ๆ เพิ่ม risk ของ uveitis → กำหนดความถี่ในการส่งตรวจตา (slit-lamp)
• งานย้อนหลังพบว่าผู้ป่วยเด็กจำนวนมากที่ถูกส่งต่อเพียงเพราะ “ANA บวก titers ต่ำ” สุดท้ายไม่มี autoimmune disease แต่เป็นกลุ่ม musculoskeletal pain, hypermobility, viral syndrome, ผิวหนัง ฯลฯ

---

11. แนวทางปฏิบัติสั้น ๆ สำหรับเวชปฏิบัติ

1.       ถามตัวเองก่อนสั่ง ANA ว่า pretest probability ของ CTD อยู่ในระดับไหน

o   ถ้าแค่ myalgia/fatigue ไม่มี sign → พยายามหลีกเลี่ยงการสั่ง

2.       ถ้าสั่งแล้ว ANA บวก

o   ประเมิน titer + pattern + clinical picture

o   เลือกส่ง specific autoantibodies แบบ “เป้าหมาย” (dsDNA/ENA/myositis panel/AMA ฯลฯ)

o   อย่ารีบติด label SLE/CTD จาก ANA อย่างเดียว

3.       ถ้า ANA ลบ แต่ยังสงสัย SLE/SjD/SSc สูง → ส่ง Ro60/Ro52, ribosomal P ฯลฯ ด้วย solid-phase และพิจารณาทบทวน pathology/analyte ของ HEp-2 ที่ใช้

4.       ไม่ใช้ ANA ติดตาม disease activity – เน้นใช้ dsDNA, complement, clinical course

5.       ผู้หญิงวัยเจริญพันธุ์ที่ ANA บวก – พิจารณาเช็ค anti-Ro/SSA, anti-La/SSB เพื่อวางแผนการตั้งครรภ์และการเฝ้าระวัง NLS

6.       เด็ก – ตรวจ ANA เฉพาะเมื่อมี clinical sign ชัด; ถ้า ANA บวกใน JIA ให้เน้นจัด schedule ตรวจตา

---